ELISA檢測(cè)原理
酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，簡(jiǎn)寫(xiě)ELISA）指將抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，把受檢標(biāo)本（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開(kāi)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的有無(wú)深淺定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
01
ELISA常見(jiàn)分類(lèi)
#1
直接ELISA
特點(diǎn)： 在直接ELISA中，被測(cè)抗原被固定在多孔板表面，用一種針對(duì)該抗原的抗體檢測(cè)，該抗體直接與HRP或其他檢測(cè)分子結(jié)合。
優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單快速，避免交叉反應(yīng)。
缺點(diǎn)：潛在高背景，沒(méi)有信號(hào)放大。
#2
間接ELISA
特點(diǎn)：固相載體包被抗原，酶標(biāo)記二抗，主要用于測(cè)抗體。
優(yōu)點(diǎn)：使用酶標(biāo)二抗增加了靈敏度，靈活大，成本低。
缺點(diǎn)：交叉反應(yīng)幾率升高。
用途：通過(guò)檢測(cè)血清中的抗體來(lái)檢測(cè)病毒，如第1，2代艾滋病診斷試劑。常用于免疫動(dòng)物血清中抗體含量的測(cè)定。
#3
夾心法ELISA(雙抗體，雙抗原）
雙抗體夾心ELISA法
特點(diǎn)：使用兩個(gè)特異性單抗或者1個(gè)特異性單抗和1個(gè)特異性多抗，固相載體包被抗體，酶標(biāo)記特異性抗體作為檢測(cè)抗體。
優(yōu)點(diǎn)：使用兩個(gè)特異性抗體檢測(cè)，特異性好。
缺點(diǎn)：成本高。
用途：用于抗原的定量檢測(cè)。
雙抗原夾心ELISA法
特點(diǎn)：使用兩個(gè)特異性抗原，固相載體包被特異性抗原，酶標(biāo)記特異性抗原作為檢測(cè)抗原，以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋?zhuān)芍苯佑糜跍y(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。
優(yōu)點(diǎn)：靈敏度、特異性高于間接法
缺點(diǎn)：反應(yīng)時(shí)間略長(zhǎng)于間接法
用途：用于抗體的定量檢測(cè)。
*RSR多款試劑盒采用橋式ELISA法（基于雙抗原夾心法原理），保證抗體檢測(cè)的高特異、高靈敏性。
#4
競(jìng)爭(zhēng)ELISA
特點(diǎn)：包被抗體，標(biāo)記抗原，樣本中的抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，標(biāo)本中抗原含量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原越少，最后的顯色也越淺。
注意：該原理強(qiáng)調(diào)抗原與抗體的充分結(jié)合，因此溫度、搖床（振速、振幅）、反應(yīng)時(shí)間等因素值得注意！
用途：小分子抗原或者半抗原的定量檢測(cè)，當(dāng)抗原材料中干擾物質(zhì)不易去除或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，多用于此方法檢測(cè)；一般小分子激素及藥物常用此法測(cè)定。
* RSR旗下AChR Ab-ELISA、TRAb 2nd-ELISA、TRAb 3rd-ELISA等都是基于競(jìng)爭(zhēng)法ELISA的原理基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的試劑盒，是該項(xiàng)目ELISA定量檢測(cè)方法，特異性均達(dá)到99%以上。
02
ELISA常見(jiàn)問(wèn)題
Q1
為什么推薦兩個(gè)主波長(zhǎng)檢測(cè)
(450nm和405nm)？
A: ELISA實(shí)驗(yàn)終止后形成的是黃色物質(zhì)，該物質(zhì)需要在450nm處測(cè)定其吸光度，當(dāng)OD450值≥3時(shí)，應(yīng)使用OD405的值進(jìn)行轉(zhuǎn)換（乘轉(zhuǎn)換系數(shù)3.4，參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)）。
RSR試劑盒中設(shè)計(jì)的空白孔屬于試劑空白，建議按照“空白孔+兩次單波長(zhǎng)檢測(cè)（405nm & 450nm）"完成實(shí)驗(yàn)，無(wú)需再設(shè)置參考波長(zhǎng)（630nm）。
Q2
CV值指的是什么？
A: CV值是統(tǒng)計(jì)學(xué)中的一個(gè)概念，中文是變異系數(shù)，可以認(rèn)為變異系數(shù)和極差、標(biāo)準(zhǔn)差和方差一樣，都是反映數(shù)據(jù)離散程度的絕對(duì)值。CV值越小，說(shuō)明數(shù)據(jù)的波動(dòng)程度越小。在描述板內(nèi)、板間實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否一致時(shí)常用到CV值，其越小，說(shuō)明批內(nèi)及批間差越小，試劑盒質(zhì)量越好。
Q3
標(biāo)曲擬合方式的最佳方法？
A:
ELISA數(shù)據(jù)處理中所謂的“標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)"其實(shí)更適合稱(chēng)為擬合曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)應(yīng)根據(jù)不同待測(cè)物質(zhì)的特性和檢測(cè)范圍選擇適當(dāng)?shù)臄M合方式。除常見(jiàn)的直線(xiàn)、多項(xiàng)式曲線(xiàn)、指數(shù)曲線(xiàn)、對(duì)數(shù)曲線(xiàn)等外，四參數(shù)Logistic回歸和三次樣條插值cubic spline擬合對(duì)定量范圍內(nèi)全域具有更良好的適用性，能夠比較精確的反映濃度和吸光度間的轉(zhuǎn)換關(guān)系，從而進(jìn)一步準(zhǔn)確獲得樣品中待測(cè)物質(zhì)的濃度值。
在RSR試劑盒中，擬合方式可根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)自行選擇4 parameters（四參數(shù)Logistic曲線(xiàn)）或cubic spline（三次樣條/仿樣曲線(xiàn)/樣條曲線(xiàn)等），通過(guò)酶標(biāo)儀搭配的計(jì)算軟件完成數(shù)據(jù)的處理，從而快速、準(zhǔn)確地完成定量檢測(cè)。
Q4
ELISA試劑盒只能檢測(cè)血清、血漿、
細(xì)胞上清液?jiǎn)幔?/span>
A: 通常我們可用于ELISA檢測(cè)的樣本是有多種類(lèi)型的，在使用前應(yīng)留意試劑盒匹配的樣本類(lèi)型，包括血清、血漿、腦脊液等常規(guī)樣品，以及尿液、細(xì)組織勻漿液、細(xì)胞裂解液等樣品。對(duì)于超出試劑盒適用樣本類(lèi)型的樣本，市面上很多廠(chǎng)家的產(chǎn)品都沒(méi)有相關(guān)的驗(yàn)證數(shù)據(jù)，客戶(hù)如有需要可以自行測(cè)試。需要注意的是，不同類(lèi)型的檢測(cè)樣本前期的處理方法是不一樣的。樣品中含有影響生物活性的物質(zhì)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。
Q5
試劑盒在使用前要室溫放置30min，
目的是什么？
A: ELISA試劑盒對(duì)于溫度的要求比較嚴(yán)格，溫度是ELISA結(jié)合反應(yīng)的重要影響因素，這樣做主要是為了使試劑溫度一致，在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地滿(mǎn)足測(cè)定要求。
Q6
樣本收集后不能及時(shí)檢測(cè)，低溫保存
可以放多久？
A: 樣本收集后應(yīng)盡快檢測(cè)。如果樣本收集后不能立即檢測(cè)時(shí)：一周內(nèi)可檢測(cè)則需將樣本置于4℃環(huán)境下，冷藏保存。3年內(nèi)檢測(cè)則需將樣本至于-20℃或更低溫度環(huán)境下保存。
Q7
樣品反復(fù)凍融影響大嗎？
A:樣品反復(fù)凍融對(duì)蛋白影響非常大，能導(dǎo)致蛋白降解，非常不建議反復(fù)凍融樣品。一般蛋白含量豐富的樣本例如血清/血漿反復(fù)凍融1-2次，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果影響不是非常大。
Q8
生物素化制劑和酶結(jié)合物，稀釋后沒(méi)用完，
還可以再用嗎？
A: 復(fù)溶的生物素化制劑和酶結(jié)合物建議依據(jù)使用說(shuō)明書(shū)內(nèi)的有效期和儲(chǔ)存條件使用，放置時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)影響其活性?？筛鶕?jù)自己實(shí)驗(yàn)所需用量進(jìn)行配制，不建議過(guò)量配制。
Q9
振蕩器的選擇
A: 建議采用酶標(biāo)板振蕩器(單板/多板)，保持震蕩速率在500 shakes/min。定軌搖床因速率過(guò)慢，不建議使用。
當(dāng)所用產(chǎn)品的檢測(cè)原理為競(jìng)爭(zhēng)ELISA法時(shí)，振蕩器的軌道直徑（振幅）更加重要。選好振蕩器能夠確保在競(jìng)爭(zhēng)法ELISA中抗原與抗體的充分結(jié)合，才能得到理想結(jié)果。RSR采用德國(guó)IKA MTS 2/4振蕩器，如下圖所示。
該產(chǎn)品軌道直徑3mm，支持1-4個(gè)ELISA板同時(shí)振蕩，且能夠確保微孔板在振蕩時(shí)既不會(huì)松脫也不會(huì)有液體飛濺。當(dāng)您不確定實(shí)驗(yàn)室的振蕩器是否滿(mǎn)足ELISA實(shí)驗(yàn)規(guī)定時(shí)，可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)以確保得到穩(wěn)定重現(xiàn)性。但這種測(cè)試費(fèi)時(shí)費(fèi)板，建議選擇相關(guān)參數(shù)的振蕩器。
Q10
變異系數(shù)(CV)較大的原因？
A:
Q11
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)較差？
A:
* 振蕩器的振速與振幅也不容忽視，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要調(diào)整振蕩器參數(shù)或更換符合標(biāo)準(zhǔn)的振蕩器。
** RSR ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)品可直接使用，避免標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、復(fù)溶不當(dāng)?shù)炔僮魇д`。
Q12
高背景或陰性對(duì)照值偏高
A:
*工作臺(tái)用漂白劑做過(guò)清潔：殘留漂白劑可以氧化TMB導(dǎo)致非特異性高信號(hào)，需要去除殘留
Q13
顯色信號(hào)弱
A:
Q14
無(wú)顯色信號(hào)
A:
Q15
標(biāo)曲佳但樣品孔無(wú)信號(hào)
A:
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