促甲狀腺激素受體(TSH Receptor,TSHR)在體內(nèi)外場景中均具有廣泛的應(yīng)用。人抗TSHR單克隆抗體可用于TSHR自身抗體(TRAb)的檢測，有助于自身免疫性甲狀腺疾病的診斷和治療。這些TSHR單抗中，以M22™代替現(xiàn)有檢測法中的TSH是目前靈敏度和特異性*高的檢測方法。目前實現(xiàn)商品化的M22™已作為世界衛(wèi)生組織促甲狀腺抗體的國際參考物質(zhì)，用于TRAb檢測方法的校準(zhǔn)。
背景
早在1956年，Adams和Purves就shou次報道了甲狀腺疾病患者血清中，存在與TSH不同的長效甲狀腺刺激因子(LATS) [1]。當(dāng)時研究發(fā)現(xiàn)LATS刺激甲狀腺的機(jī)制與血清蛋白的IgG部分相關(guān)。1974年，RSR創(chuàng)始人Smith博士與Hall的聯(lián)合研究證實了Graves病患者血清中這種因子實質(zhì)上是特異性靶向TSHR的自身抗體（即TRAb），而TRAb對TSHR的刺激是造成Graves病患者甲狀腺功能亢進(jìn)的病因[2]。這一研究結(jié)果促進(jìn)了第一代TRAb體外檢測方法的發(fā)展，為自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)的輔助診斷和管理提供依據(jù)。
TSHR研究的下一個重要里程碑是1989 - 1990年，在四個獨(dú)立實驗室中克隆了TSHR基因[3-7]。這為TSHR單克隆抗體的體外制備提供更多基礎(chǔ)。
2003年，Smith博士從一名Graves病患者的外周血淋巴細(xì)胞中，分離出促甲狀腺激素受體單克隆自身抗體(稱為M22™)[8]。隨后發(fā)現(xiàn)的多種TSHR單克隆自身抗體中，按生理功能又可為兩種阻斷型單抗(5C9和K1-70)和一種刺激型單抗(K1-18)[9]。重組TSHR基因表達(dá)技術(shù)的發(fā)展，配合目前已發(fā)現(xiàn)的TSHR單抗，使TSHR富亮氨酸重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRD)可與M22和K1-70的Fab片段結(jié)合為抗原抗體復(fù)合物，以結(jié)晶形式得以提取[10,11]。這為后續(xù)研究中TSHR LRD與兩種不同效應(yīng)的單克隆抗體間分子的相互作用提供助益[10,11]。
當(dāng)前多項研究成果證實，體外環(huán)境中的小鼠胚胎干細(xì)胞可以通過TSH刺激，定向轉(zhuǎn)化為功能正常的甲狀腺濾泡細(xì)胞。這為長期接受激素替代治療的甲狀腺疾病患者，開辟了功能恢復(fù)性治療的新前景[12,13]。我們在近期的研究中還建立了Graves眼病(GO)的小鼠模型[14]，并制備了具有熱穩(wěn)定性的TSHR LRD制劑，shou次解析了無配體的糖蛋白激素受體結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)（2.83 Å分辨率）[15]。這些重大的科學(xué)結(jié)果不斷促進(jìn)對AITD患者診斷、監(jiān)測以及管理的改進(jìn)。
TRAb的體外應(yīng)用實例
如上所述，在Graves病發(fā)病機(jī)制中，患者血清中的自身抗體對TSHR的刺激起核心作用。因TRAb檢測的重要性，TRAb的檢測方法也歷經(jīng)了多代的發(fā)展：
一代檢測：
液相檢測法，利用血清TRAb可以抑制放射性I-125標(biāo)記的TSH與TSHR相結(jié)合的特性，使用聚乙二醇將抗原抗體復(fù)合物沉淀[16]。該檢測法是Graves病診斷的一個里程碑。在早期開展的生物檢測法中，通常以刺激型抗體TSAB或TSH對表達(dá)TSHR的活細(xì)胞進(jìn)行刺激，以其產(chǎn)生的第二信使cAMP作為檢測標(biāo)志物來間接檢測TRAb。該試驗法耗時較久且流程復(fù)雜，不適宜大規(guī)模檢測。一代液相法作為替代方案改變了這一局面。
二代檢測：
第二代檢測改為固相檢測法，樣品中的TRAb與固定在ELISA微孔或塑料管上的TSHR相結(jié)合，隨后與生物素或I-125標(biāo)記的TSH反應(yīng)實現(xiàn)檢測[17]。固相檢測法實現(xiàn)了非放射性同位素標(biāo)記和檢測自動化，與第一代檢測法相比，提高了方法學(xué)的靈敏度和特異性。
三代檢測：
在新的第三代檢測中，以M22-生物素替代二代檢測中的TSH-生物素，從而進(jìn)一步提高了靈敏度和特異性[18]。與二代檢測中TSH與TSHR間的結(jié)合相比，M22因其復(fù)合物不易解離，在TRAb的競爭抑制法檢測中更具有優(yōu)勢。這一特性使配體在嚴(yán)格的洗滌步驟里保持緊密結(jié)合，使其更適合用于自動化檢測系統(tǒng)。第三代TRAb檢測目前在各地的各個平臺上廣泛應(yīng)用。即使檢測時長控制在半小時內(nèi)，也能保持良好的靈敏度和特異性[18,19]。
TRAb的濃度通常以IU/L表示，單位定義參考了國家生物標(biāo)準(zhǔn)和控制研究所(NIBSC)提供的世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該類物質(zhì)通常用于TRAb檢測方法的校準(zhǔn)。第一代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(編號90/672)源自一位患者的捐贈。隨著第一代標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的耗竭，M22™的開發(fā)誕生了第二代國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(編號08/204)。在NIBSC 08/204標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中，每支安瓿的正常人血清中含有1 μg凍干M22 IgG。當(dāng)前M22™已規(guī)?；懂a(chǎn)，實現(xiàn)了從實驗室研究向產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的轉(zhuǎn)變。（RSRTJ解讀：保證了M22的產(chǎn)出及供應(yīng)問題。）
TSHR的體外應(yīng)用實例
用TSHR260-JMG55替換對應(yīng)片段后的全長TSHR，無論是對TSH或M22的刺激信號反饋，還是結(jié)合Graves病患者的TSHR自身抗體時，耐熱型TSHR均與野生型TSHR的性能表現(xiàn)接近[15]。這些試驗均證實，耐熱突變不影響TSHR本身的抗原性。
TSHR的體內(nèi)應(yīng)用研究
在目前的設(shè)想中，穩(wěn)定的TSHR制劑可以對患者體內(nèi)的血清TRAb特異性免疫吸附。在需要從患者外周循環(huán)中緊急清除TRAb的危急臨床危重情況下，通過TRAb與TSHR260-JMG55結(jié)合的機(jī)制，將TRAb從患者血漿中分離，從而提供快速有效的治療效果。
腫瘤治療展望
在甲狀腺癌的控制策略上也可提供新思路：通過一種含TSH片段的納米脂質(zhì)體，裝載化療藥物后靶向到達(dá)病灶處的TSHR[24]。另一種方法基于TSHR結(jié)合碳納米管，這種納米管能將外部光能轉(zhuǎn)化為熱能，從而在局部殺死癌細(xì)胞[25]。此外，針對TSHR的小分子拮抗劑，通過抑制信號通路的方法來抑制甲狀腺癌進(jìn)展[26]。目前在Graves病患者的臨床試驗中，采用K1-70單次遞增劑量給藥，已開展涉及安全性、耐受性、藥代動力學(xué)和藥效學(xué)的I期臨床研究（結(jié)果已于22年發(fā)表）。
K1-70藥用化實例
一名患有Graves病、嚴(yán)重GO和局部晚期伴遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的高分化甲狀腺濾泡癌的女性患者，曾接受了K1-70作為藥物的藥效觀察[27,28]。給藥前該患者GO臨床活動評分(CAS)為6/7，復(fù)視，雙眼突出量21 mm，伴水腫、眼瞼腫脹、眼球運(yùn)動時疼痛、眼瞼紅斑。她開始接受為期3周，個體化定制劑量的K1-70用藥，旨在中和她體內(nèi)高水平的促甲狀腺刺激型自身抗體。第一次給藥時TRAb為130 IU/L，甲狀腺刺激活性>2000%。該患者同時服用樂伐替尼治療甲狀腺癌。患者反饋稱在開始K1-70治療后不久，她的眼部癥狀有所改善；CAS提高到0-1/7，雙側(cè)突出量改善為19 mm，可通過手術(shù)矯正復(fù)視。接受K1-70治療期間，患者恢復(fù)了駕駛能力，GO一并轉(zhuǎn)入穩(wěn)定期。在樂伐替尼因副作用而停藥期間，僅K1-70單獨(dú)用藥，也觀察到腫瘤進(jìn)展放緩。在持續(xù)K1-70治療2年且劑量提高至120 mg/次時，該患者身上仍未觀察到不良反應(yīng)。
這些早期研究表明，用K1-70阻斷TSHR活性的體內(nèi)治療方式，在控制Graves病、GO和甲狀腺癌中甲狀腺功能亢進(jìn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。
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參考文獻(xiàn)：Furmaniak, J., et al. "Practical applications of studies on the TSH receptor and TSH receptor autoantibodies." Endocrine 68.2 (2020): 261-264.
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