文章來源于罕見病信息網(wǎng)，譯：田璟鸞 校:黃娟
1. 背景
視神經(jīng)脊髓炎(NMO)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫脫髓鞘疾病，主要累及視神經(jīng)和脊髓，其特征是患者血清中存在水通道蛋白4抗體。2004年，梅奧診所的研究團隊初次在NMO患者血清中發(fā)現(xiàn)了一種特異性的、在小鼠大腦的血腦屏障處或附近結(jié)合的NMO -免疫球蛋白G(IgG)。2005年，NMO-IgG的抗原決定簇被鑒定為水通道蛋白4（AQP4），一種在血腦屏障的星形膠質(zhì)細胞足突中密集表達的水通道蛋白。AQP4有兩種主要的異構(gòu)體，M1異構(gòu)體：全長323個氨基酸，翻譯起始點在Met-1，M23異構(gòu)體：較短的301個氨基酸，翻譯起始位點為Met-23。這兩種異構(gòu)體有22個n端胞質(zhì)氨基酸的差異，雖然不是AQP4抗體的靶點，但影響細胞表面蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)。兩種異構(gòu)體均可組裝成四聚體AQP4；但只有M23異構(gòu)體在細胞膜上以規(guī)則的方形排列，稱為正交四聚體(OAP)。2006年，血清中水通道蛋白4抗體的陽性檢測結(jié)果已納入修訂的NMO診斷標準。因此，一種靈敏度高、特異性強的水通道蛋白4抗體檢測方法對于診斷和治療這種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要的臨床意義。自從發(fā)現(xiàn)抗AQP4抗體以來，已經(jīng)提出了幾種檢測方法，包括對小鼠、大鼠或靈長類組織的各種冷凍切片進行間接免疫熒光法(IIF)，轉(zhuǎn)染細胞表達人AQP4的IIF，通過熒光顯微鏡來直觀定量（CBA）或通過流式細胞術（FACS）；以及酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫沉淀法(RIPA)和熒光免疫沉淀法(FIPA)檢測部分純化的AQP4。然而，這些方法的診斷準確性(如靈敏度和特異性)差異很大。許多技術方面的因素可能會影響測定準確性，包括所使用的切片的類型和種類，轉(zhuǎn)染和固定方法，AQP4的物種和異構(gòu)體。目前，CBA平均診斷準確率為76.5%，明顯高于其他方法(48.5-62.3%)。然而，CBA僅提供半定量結(jié)果，結(jié)果判讀依賴于觀察者，尤其是測定血清抗體滴度時存在勞動強度大，耗時長的缺陷。基于蛋白質(zhì)的檢測方法，如ELISA法，可能解決上述這些技術問題：易于使用，可大樣本量分析，并可實現(xiàn)自動化檢測。Hayakawa等（2008）第一次以重組大鼠AQP4為包被抗原，采用ELISA法直接檢測血清AQP4抗體。而Kim等（2012）以人的AQP4作為包被抗原的ELISA法獲得相似靈敏度，但特異性更高。此后不久，RSR有限公司(Cardiff, UK) 使用M1-AQP4異構(gòu)體研制出第一款商用ELISA試劑盒，但據(jù)Isobe（48.3%），F(xiàn)ryer（58%）和Jarius(78.5%)等報道的該款ELISA檢測靈敏度，還不能作為一個有效的CBA替代方案。最近，RSR有限公司開發(fā)了一種新版的基于人類重組AQP4 M23異構(gòu)體的ELISA檢測方法。本研究旨在評價這種新型M23-ELISA產(chǎn)品在全自動檢測系統(tǒng)上的分析和臨床準確性。
2. 材料與方法
2.1 病例
從4個意大利境內(nèi)中心收集了64例NMOSD患者(24例NMO, 24例LETM, 13例單獨ON, 3例脊髓炎) 和27例對照組(17例多發(fā)性硬化(MS)和10例健康受試者(HS))的血清樣本。所有NMO患者都符合Wingerchuk 2006年的標準。所有LETM患者均被臨床確診為至少三節(jié)的脊髓病變。多發(fā)性硬化癥的診斷依據(jù)McDonald標準。同樣的血清樣本曾使用間接免疫熒光法（IIF）產(chǎn)品(“Neurology Mosaic 17", Euroimmun, Luebeck, Germany)檢測NMO-IgG。
表1 患者和對照組的人口統(tǒng)計學、臨床和血清學特征
2.2 方法
AQP4抗體檢測采用RSR AQP4Ab ELISA 新產(chǎn)品, 包被的人重組AQP4 M23異構(gòu)體（RSR Ltd），在全自動ELISA操作系統(tǒng)（SkyLAB 752 DASITGroup, Cornaredo, Italy）完成。
2.3分析評估
· 精密度研究
使用RSR ELISA產(chǎn)品中兩種商用陽性對照血清(AQP4 Ab C-1，12.1 U/mL和C-2，28 U /mL)，在不同日內(nèi)進行了5次獨立的試驗，每次均進行3次重復的檢測，以驗證批內(nèi)、不同日間和實驗室內(nèi)精準度。符合臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)的EP15-A3指南。
· 統(tǒng)計分析
使用ANOVA方差分析評估批內(nèi)、不同日間和實驗室內(nèi)精密度。使用受試者工作特征曲線（ROC曲線）確定AQP4抗體檢測合適的臨界值。使用NMOSD組患者的AQP4抗體檢測結(jié)果進行靈敏度分析，用對照組檢測結(jié)果進行特異性分析。采用似然比 (LR)評價ELISA的臨床應用價值。根據(jù)常規(guī)，LR (陽性似然比)陽性>10或LR (陰性似然比)陰性< 0.1的檢測被認為是臨床有用的。Kruskal-Wallis檢驗用于評估患者組和對照組之間的AQPR抗體水平差異，Mann-Whitney unpaired U檢驗用于比較不同組的抗體中位數(shù)水平。用Fisher’s exact檢驗評估NMO和LETM患者AQP4抗體占比的差異。P值＜0.05認為統(tǒng)計學有顯著差異。使用MedCalc軟件（Marialerke, Belgium）進行ROC曲線分析，使用GraphPad Prism Version 5和Analyse-it Version 4.10.2.進行所有的統(tǒng)計分析。
3. 結(jié)果
3.1精密度測試
C-1的平均濃度為12.41 U/mL，批內(nèi)CV%為3.2%，不同日間CV%為7.6%，實驗室內(nèi)CV%為8.2%。C-2平均濃度為28.12 U/mL，批內(nèi)CV%為3.0%，不同日間CV%為7.4%，實驗室內(nèi)CV%為8.0%?？傊貜托?，以標準差(SD)表示(實驗室內(nèi))，C-1結(jié)果為1.02，C-2結(jié)果為2.25，分別接近制造商所聲明的基于重復性獲得的驗證值1.96和4.20（SD C-1=1.30 和SD C-2=2.77），精密度測試的數(shù)據(jù)見表2。
表2 根據(jù)CLSI EP15-A評價AQP4抗體ELISA檢測的精密度
3.2 AQP4抗體檢測
ELISA可實現(xiàn)對AQP4抗體水平的定量檢測。在NMOSD患者中，抗體濃度范圍在1.5 U/mL和464 U/mL間?？贵w濃度中位數(shù)為NMO患者27.9 U/mL (1.5-464 U/mL)，LETM患者1.5 U/mL (1.5-214.5 U/mL)，ON和脊髓炎患者分別為1.5 U/mL (1.5-1.9 U/mL) 和1.5 U/mL (1.5-3.1 U/mL)。對照組的平均濃度為1.5 U/mL (1.5-2.1 U/mL)。NMO組血清中抗AQP4抗體濃度中位數(shù)高于其他NMOSD組和對照組(Kruskal-Wallis檢驗，p < 0.0001)。尤其是，NMO患者抗AQP4抗體濃度中位數(shù)高于LETM和ON患者（圖1）。
圖1 NMO患者，LETM患者，ON患者，脫髓鞘患者及對照組（包括：多發(fā)性硬化（MS）和健康研究對象（HS））中AQP4自身抗體水平的分布，以Unit/mL表示。Kruskal Wallis test, p < 0.0001; NMO患者的AQP4抗體水平中位數(shù)在統(tǒng)計學意義上高于LETM和ON患者的抗體水平 (Mann–Whitney Unpaired U-test, p = 0.0006 and p < 0.0001, respectively)
由ROC曲線確定臨界值為2.1U/mL，ELISA檢測AQP4抗體在NMO患者的靈敏度為83.3% (95% CI 62.6% ~ 95.2%)，特異性為100% (95% CI 87.1%-100%)，以及非常高的陽性似然比(∞) 和陰性似然比(0.17)(表 3)。NMO患者的計算出的曲線下面積(AUC)的值為0.895 (95% CI 0.777-0.963) (圖2)。
圖2 a NMO患者AQP4自身抗體的(ROC)曲線分析。曲線下面積(AUC)是0.895。B LETM患者AQP4自身抗體檢測的ROC曲線分析。AUC是0.625。連續(xù)線為ELISA法；虛線表示95%的置信區(qū)間
表3 NMO和LETM患者的診斷靈敏度、特異性和似然比(陽性似然比、陰性似然比)
在相同的臨界值下，LETM患者的靈敏度和特異性分別為25% (95% CI 9.8%-46.7%)和100% (95% CI 87.1%-100%)，陽性似然比是∞，陰性似然比是0.75（表3）。
NMO患者與LETM患者AQP4抗體比例的差異有統(tǒng)計學意義(分別為83.3%和25%)( Fisher exact檢驗，p = 0.0001)。
13例ON患者組均為AQP4抗體陰性，3例脊髓炎患者組除1例外其他2例為AQP4抗體陰性。所有對照均為AQP4抗體陰性。
間接免疫熒光法（IIF）與ELISA方法的結(jié)果*一致 (Cohen’s Kappa = 1.00)。
4. 討論
AQP4抗體是輔助診斷NMO患者的一個重要的工具，并已被納入該疾病的修訂診斷標準。最近，AQP4抗體也在單一橫貫脊髓炎患者、單一視神經(jīng)炎患者以及患有NMOSD并同時存在結(jié)締組織疾病的患者中被發(fā)現(xiàn)。因此，國際NMO診斷小組(IPND) 根據(jù)患者血清中AQP4抗體的存在，引入了新的命名法和新的診斷標準。新命名將所有與NMO相關的疾病統(tǒng)一為NMOSD，進一步分為AQP4抗體陽性的NMOSD、AQP4抗體陰性的NMOSD和AQP4抗體狀態(tài)不明的NMOSD。這些新標準使需要檢測水通道蛋白4抗體的臨床病例數(shù)量增加。
檢測AQP4抗體的重要性不僅因為NMO與MS盡早和準確的鑒別診斷，并且還因為兩者治療策略的差異。諸如β-干擾素和醋酸格拉替雷(Copaxone)的免疫調(diào)節(jié)藥物被認為是多發(fā)性硬化癥的第一選擇，免疫抑制藥物特別是B細胞靶向治療被認為是治療NMO的有利因素。
多種AQP4抗體的檢測方法已經(jīng)被研發(fā)。其中基于AQP4-M1異構(gòu)體的血清學檢測是首先被使用的方法。直到近些年，隨著OAPs被證明為是NMO-IgG主要的靶點，AQP4-M23才被越來越廣泛地用作靶點抗原。
Kim等使用內(nèi)部ELISA，同時檢測了兩種異構(gòu)體，在確診或高危NMO患者的檢出率方面，沒有發(fā)現(xiàn)異構(gòu)體之間的任何差異，他們選擇使用M23異構(gòu)體，因為它提高了信噪比。同樣的，Waters等通過商用CBA，在比較人類M1或M23異構(gòu)體時，沒有發(fā)現(xiàn)靈敏度的差異，但使用M23的信號增加。Mader使用活的人胚胎腎(HEK)細胞，發(fā)現(xiàn)M23異構(gòu)體的靈敏度更高。這些作者還觀察到兩種方法中不同的染色模式。與M23異構(gòu)體相比，與M1異構(gòu)體結(jié)合的抗體顯示出更小的染色斑點，這支持了之前的數(shù)據(jù)，M23異構(gòu)體在HEK細胞中形成OAP。
此外，使用NMO患者的血清和重組AQP4特異性單克隆抗體，Crane等發(fā)現(xiàn)，由于OAP結(jié)構(gòu)的原因，M23比M1在AQP4-IgG單克隆抗體或其Fab片段上顯示出具有持續(xù)的更高的親和力，這再次表明AQP4異構(gòu)體的選擇以及OAP的結(jié)構(gòu)可以直接影響檢測靈敏度。
本研究的目的是評價一種新的商用M23抗原ELISA檢測AQP4抗體的性能。結(jié)果與間接免疫熒光法商用IIF產(chǎn)品的結(jié)果進行比較。雖然沒有直接與使用M1-AQP4的ELISA進行比較，但我們的數(shù)據(jù)顯示，靈敏度(83.3%) 高于之前使用M1異構(gòu)體的研究報告，與CBA獲得的平均靈敏度相似(76.7%；范圍55.6-96.7%)，顯著高于其他方法(范圍48.5-62.3%)。
最后，ELISA檢測結(jié)果與目前檢測AQP4抗體的參考方法（間接免疫熒光法IIF）檢測結(jié)果一致(100%一致)。
我們的研究也旨在評價這種新的AQP4 抗體ELISA分析方法的準確性。它的重要性在于，因為一些方法在不同的實驗室應用時產(chǎn)生了不一致的結(jié)果，同一樣品在不同的檢測方法中檢測出不一致的結(jié)果。然而，結(jié)果可重復的AQP4抗體檢測對于大型多中心研究來說至關重要，這些研究旨在更好地確定NMO患者的流行病學、臨床和病理特征以及他們對治療的反應。
我們發(fā)現(xiàn)，使用兩種不同抗體濃度檢測批內(nèi)、不同日間和實驗室內(nèi)以CV表示的精密度變異系數(shù)低，在對低濃度和高濃度AQP4抗體的陽性對照上測量的總重復性甚至比相同濃度水平下制造商所聲稱的更好。
該檢測具有良好的分析精密度和準確度，以及在全自動系統(tǒng)上體現(xiàn)的相對易用和快速響應的的特性，證明該檢測對于適用于日常檢測，并可能適合用于AQP4抗體的長期監(jiān)測。
本研究的進步意義體現(xiàn)在兩個重要方面。一方面是可以使各家實驗室獲得簡單易用的AQP4抗體定量方法，另一方面是這款新的ELISA方法在特異性與靈敏度上的良好表現(xiàn)，其性能與當下的金標準CBA方法一致。
本研究初次評價了一種新型的商用ELISA檢測AQP4抗體的方法，是一種有效的CBA替代方法。我們相信，我們的發(fā)現(xiàn)可以為輔助AQP4抗體檢測奠定基礎，從而促進對NMOSD病人更早、更準確的診斷。
參考文獻：Tampoia M , Abbracciavento L , Barberio G , et al. A new M23-based ELISA assay for anti-aquaporin 4 autoantibodies: diagnostic accuracy and clinical correlation[J]. Auto-Immunity Highlights, 2019, 10(1).
原文標題：
A new M23-based ELISA assay for anti-aquaporin 4 autoantibodies: diagnostic accuracy and clinical correlation
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