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標題： 在自動化系統(tǒng)上(SkyLAB 752) 用ELISA 方法檢測乙酰膽堿受體抗體：根據(jù)臨床和實驗室標準協(xié)會 (CLSI) EP15-A 評估其分析性能  

作者：Letizia Abbracciavento1, Ruggiero Fumarulo1, Marilina Tampoia1  

摘要：

背景： 乙酰膽堿受體抗體 (AChRAb) 目前在臨床實驗室中主要通過放射免疫測定法來檢測，該法利用從人體肌肉中提取的受體并通過¹²⁵I-α-金環(huán)蛇毒素標記進行檢測和定量。Hewer 等人（2006）基于純化的胎兒和成人乙酰膽堿受體的用途，開發(fā)了一種新的酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA)。根據(jù)臨床和實驗室標準協(xié)會 (CLSI) 的建議，本研究的目的為驗證 ELISA 測試并制定其在自動儀器上的實施方案。  

方法： 為了得到批內(nèi)，不同檢測日間和實驗室內(nèi)的精密度，我們使用RSR Ltd廠家診斷試劑盒中的兩種 AChRAb 對照品，一種高值陽性對照品 (C1) 和一種低值陽性對照品 (C2)，在不同日內(nèi)進行了5次獨立的試驗，每次均進行3次重復檢測。診斷試劑盒中包含四種不同濃度的標準品（E1，0.5 nmol/L；E2，1.0 nmol/L；E3，6.5 nmol/L；E4，20 nmol/L），為驗證正確度，進行連續(xù)五天重復測試。

結(jié)果：在精密度測試過程中，高值對照品的檢測平均濃度為 11.2 nmol/L（對照 C1），其批內(nèi)CV值為7.9%（95% CI，0.61~1.52），不同檢測日間CV值為 8.4%（95% CI，0.00~2.98），實驗室內(nèi)CV值為11.5%（95%CI，0.92~3.12）。低值對照品的檢測平均濃度為3.2 nmol/L（對照 C2），批內(nèi)CV值為5.6%（95% CI，0.13~0.32），不同檢測日間CV值為1.9%（95% CI，0.00~0.33）， 實驗室內(nèi)CV值為6.0% （95% CI，0.15 ~ 0.39）。以標準偏差 (SD) 表示（實驗室內(nèi)）的總重復性，C1 為 1.27，C2 為 0.19，更優(yōu)于廠家聲明的重復性獲得的驗證值（分別為 1.37 和 0.49）[ SD (C1) = 0.95874 和 SD (C2) = 0.3589]。

結(jié)論： 在真實世界中獲得的分析性能證實了在實驗階段產(chǎn)生的產(chǎn)品規(guī)范參數(shù)，并表明即使使用自動化系統(tǒng)進行分析，測試的可靠性仍然保證。測試的良好精密度和準確度及其在易用性和快速響應的自動化系統(tǒng)上的可用性使我們得出結(jié)論，該測試對于常規(guī)使用是令人滿意的，并且可適用于 AChRAb 的長期監(jiān)測。  

關鍵詞：乙酰膽堿受體抗體，酶聯(lián)免疫吸附試驗，臨床和實驗室標準協(xié)會，驗證  

正文：

簡介: 重癥肌無力(MG)是一種以神經(jīng)肌肉傳遞障礙為特征的自身免疫性疾病，乙酰膽堿受體自身抗體(AChRAb) 的檢測是診斷重癥肌無力 (MG) 一種非常有效且廣受認可的方法。

AChRAb可以與成人和胎兒AChR的不同亞基發(fā)生反應；然而，大多數(shù) (50%)是與α亞基胞外區(qū)特定的免疫顯性區(qū)域結(jié)合[1]。

目前，這些自身抗體的常規(guī)檢測主要基于用¹²⁵I-α-BuTx 標記的人類 AChR，¹²⁵I-α-BuTx是一種與AChR親和度高的蛇毒素。

盡管放射免疫法檢測AChRAb被廣泛應用，但使用放射性化合物有技術和環(huán)境上的限制。因此，使用不同技術和不同的抗原制備的檢測法作為放射免疫法的替代方法被提出。  

2006年，Hewer 等在使用純化的胎兒和成人AChR的基礎上開發(fā)了一種新的酶聯(lián)免疫吸附測定法 (ELISA) [2]。

這種 ELISA 方法顯示出良好的靈敏度(92%) 和出色的特異性(99%)。此外，比較ELISA法和RIA法，顯示兩種檢測法之間有很好的一致性（r = 0.85，n = 83，P<0.001）

為了確保滿足建立專業(yè)認可的自身免疫實驗室所需的要求，我們根據(jù)臨床和實驗室標準協(xié)會 (CLSI) 的建議，驗證了 ELISA 測試并制定了在自動儀器上的實施方案 [3]。

此外，一旦實施并成為用戶的例行程序后，該方法可以通過經(jīng)認可的外部質(zhì)量評估計劃(UK NEQAS)的參與進行監(jiān)控。  

材料與方法  

AChRAb ELISA 

Anti-AChRAb ELISA（RSR Ltd，Cardiff，UK）基于競爭抑制法。

自動 ELISA 操作系統(tǒng)  

根據(jù)廠家的建議，我們實驗室使用Sky-LAB 752自動ELISA操作系統(tǒng)（DASITGroup，Cornaredo，Italy）進行AChRAb 測試。

方法驗證  

精密度和真值是驗證測試所需的性能參數(shù)，根據(jù) CLSI 指南 EP15-A [3] 中的描述進行評估。為了得到批內(nèi)，不同檢測日間和實驗室內(nèi)的精密度，我們使用RSR Ltd廠商試劑盒中的兩種商業(yè) AChRAb 對照品，一種高值陽性 (C1, 7.5 nmol/L) 和一種低值陽性 (C2, 1.6 nmol/L)，在不同日內(nèi)進行了5次獨立的試驗，每次均進行3次重復檢測。為研究正確度，對診斷試劑盒中包含的四種不同濃度水平的標準品（E1，0.5 nmol/L；E2，1.0 nmol/L；E3，6.5 nmol/L；E4，20 nmol/L）進行連續(xù)五天復孔檢測。

外部質(zhì)量評估

一旦實施并且該方法成為用戶的常規(guī)方法，我們于2016年4月至2017年10月參與了英國 NEQAS 質(zhì)量控制以評估AChRAb的檢測。

統(tǒng)計分析

ANOVA測試用于計算批內(nèi)變異系數(shù) (CV)% 和實驗室內(nèi) CV%。 使用Analyze it軟件版本4.21進行統(tǒng)計分析。

結(jié)果  

精密度分析

表 1 和表 2 顯示了 5 天內(nèi)獲得的測定值、平均值、標準偏差 (SD) 和方差。

精密度實驗中兩個陽性對照樣品（C1 和 C2）的結(jié)果見表 3。

總重復性以 SD（實驗室內(nèi)）表示，結(jié)果 C1 為 1.27，C2 為 0.19，低于根據(jù)制造商聲明的重復性驗證值（分別為 1.37 和 0.49），以SD表達 [C1 的 SD = 0.95874 和 C2 的 SD = 0.3589]。

表1  AChRAb 高濃度陽性對照品 (C1, 7.5 nmol/L)5天的檢測值、平均值、標準差（SD）和方差  表2  AChRAb 低濃度陽性對照品 (C2, 1.6 nmol/L)5天的檢測值、平均值、標準差（SD）和方差   表3  根據(jù) CLSI EP 15-A 使用廠商提供的 2 個陽性對照品（C1 和 C2）進行的精密度實驗 表4 根據(jù)標準 CLSI EP15-A 使用廠商提供的4個標準品進行正確度實驗

正確度研究

使用四種標準品檢測分析正確度顯示測定值的平均值與真實值之間具有良好的相關性。差異（系統(tǒng)誤差）是可以接受的，正如 P 值所證明的那樣，這些 P 值無統(tǒng)計學差異（表 4 和圖 1）。

圖 1 分析方法的不精確估計（系統(tǒng)誤差）

AChRAb 的室間質(zhì)量評價 

對 UK NEQAS 報告提供的數(shù)據(jù)分析表明，我們的結(jié)果在定性數(shù)據(jù)（陽性/陰性）方面與所有其他 110 個參與實驗室（Cohen's k = 1.000）一致。關于定量數(shù)據(jù)，我們的結(jié)果與使用我們 ELISA 方法的實驗室的平均值沒有顯示出統(tǒng)計學差異（Mann-Whitney 檢驗 p = 0.06）。然而，我們注意到 ELISA 結(jié)果在統(tǒng)計學上高于使用 RIA 方法獲得的結(jié)果（Mann-Whitney 檢驗 p = 0.0004）。

討論

AChRAb的測定是MG診斷和臨床隨訪的基本實驗室支持[4, 5]。即使AChRAb 滴度不總是與疾病的嚴重程度相關，但單個患者的連續(xù)測定結(jié)果可能顯示出與MG癥狀的很好相關性 [6]。

盡管過去推薦的AChRAb 診斷方法是 RIA法，但ELISA方法已經(jīng)被認為是一種合適的技術 [7]。事實上，英國 NEQAS 報告提供的數(shù)據(jù)顯示，大約一半的參與實驗室使用市售的ELISA方法。將ELISA法測定結(jié)果與常規(guī) RIA 方法進行比較，來評估其分析性能，發(fā)現(xiàn) RIA 和 ELISA 之間具有很好的一致性 [2]。

根據(jù)自身免疫實驗室應遵守的技術要求[8]，我們驗證并證實了市售AChRAb ELISA在自動化測試時的分析準確性。

使用 SKYLab 752 儀器，我們發(fā)現(xiàn)以批內(nèi)精密度、不同檢測日間精密度和實驗室內(nèi)精密度表示的分析誤差介于 1.9% 至 11.5% 之間，與其他自身抗體測定相比，該水平的誤差*可接受 [9]。在低水平和高水平AChRAb 陽性對照品上測得的總體重復性，更優(yōu)于制造商聲明的性能指標[3]。

因此，在真實世界中獲得的分析性能確認了在實驗階段中形成的產(chǎn)品規(guī)格參數(shù)，并表明即使在自動化系統(tǒng)中進行分析時，測試的可靠性仍然保證。

總體而言，該測試的良好精密度和準確度及其在易用性和快速響應性的自動化系統(tǒng)上的可用性，使我們得出結(jié)論：該測試對于常規(guī)使用上是令人滿意的，并且可能適用于長期監(jiān)測AChRAb。

為了確保自身免疫實驗室質(zhì)量體系的要求，我們參加了一次有組織的實驗室間比較，我們的結(jié)果與參與室間質(zhì)量評價的其他實驗室的結(jié)果非常吻合 [8]。

因此，我們獲得的定性結(jié)果與使用相同 ELISA 方法測定AChRAb 的其他實驗室提供的平均數(shù)據(jù)一致。相反，使用RIA方法的實驗室提供的定量數(shù)據(jù)低于ELISA方法提供的數(shù)據(jù)。

這種差異的可能解釋可以用標準品的ELISA 曲線動態(tài)范圍來表示?？贵w濃度測定中的這種差異阻礙了用兩種方法獲得的結(jié)果之間的定量比較。

在建立自身抗體檢測的參考標準上，幾項行動已實施。例如疾病預防控制中心（CDC）近期批準了一種用于抗環(huán)瓜氨酸肽抗體檢測的參考物質(zhì)[10]。乙酰膽堿受體抗體同樣需要參考物質(zhì)，為了能夠以國際單位IU對乙酰膽堿受體抗體的檢測數(shù)據(jù)實現(xiàn)定量表示，并協(xié)調(diào)和標準化這種自身抗體的測定。

｜原文來自｜

作者：Abbracciavento L ,  Fumarulo R ,  Tampoia M .

題目：Anti-AChR antibodies detected by ELISA method using an automated system (SkyLAB 752): evaluation of the analytical performance according to the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP15-A[J].

期刊：Italian Journal of Laboratory Medicine

發(fā)表時間：2018.1.3

作者單位：Autoimmunology Section, Universitary Clinical Pathology Unit, Polyclinic of Bari, Department of Biomedical Sciences and Human Oncology, University of Bari Medical School, Bari, Italy

譯：RSRTJ